暨南大学吴建国教授/潘攀研究团队 ，在Nature子刊《Nature Communication》发表题为“CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce
hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ） ，该研究展示了CoV-2
N蛋白通过促进NLRP3炎症小体激活诱导高炎症反应；N蛋白促进促炎因子的成熟 ，并诱发细胞和小鼠的促炎反应；N蛋白直接与NLRP3蛋白相互作用 ，促进NLRP3与ASC结合 ，促进NLRP3炎症小体组装；N蛋白加重脓毒症和急性炎症小鼠模型中肺损伤 ，加速死亡 ，促进小鼠IL-1β和IL-6激活。
首先 ，CoV-2感染巨噬细胞和树突细胞(DCs)后多种促炎因子趋化因子及配体均有不同程度增加；研究人员对CoV-2蛋白对IL-1β释放的影响进行研究 ，WB结果显示N蛋白在HEK293T细胞表达最高(Fig.1c) ，ELISA结果显示N蛋白表达的HEK293T-NLRP3炎症小体体系IL-1β最高(Fig.1d) ，CoV-2
N蛋白加强Nigericin诱导的IL-1β分泌(Fig.1e)。因此CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟及分泌中发挥重要作用。N蛋白介导THP-1包含IL-1β在内的炎症因子表达 ，
MCC950(NLRP3特异性抑制剂)可以抑制上述炎症因子的表达(Fig.1g)。利用AAVlung-N在小鼠肺中表达N蛋白 ，AAVlung-N可以显著增加IL-1β ，IL-6 ，TNF ，CXLC10 ，CCL2 ，IL-11 ，IL-7和CXCL8的mRNA表达 ，另外Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制剂 ，阻断IL-1β成熟)和MCC950对AAVlung-N诱导的上述因子表达均有不同程度的恢复作用(Fig.1h&1i)。因此 ，研究人员推测N蛋白促进NLRP3炎性小体激活 ，从而诱导成熟IL-1β分泌 ，进而在诱导炎症因子和细胞因子中发挥关键作用。结果表明 ，CoV-2
N蛋白在诱导促炎因子中发挥关键作用 ，N蛋白可能参与调节NLRP3炎症小体的激活。
考虑到激动剂对促炎因子表达的主导作用 ，接下来研究人员对CoV-2
N蛋白在IL-1β成熟中的作用进行研究。研究发现N蛋白可以促进IL-1β的分泌、IL-1β
cleavage和Caspase-1成熟且呈现剂量依赖 ，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可诱导IL-1β的分泌和cleavage ，N蛋白可以进一步促进IL-1β的分泌和cleavage(Fig.2a&2b)。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以促进THP-1细胞IL-18和IL-6 ，N蛋白仅能促进IL-6的分泌 ，不能促进IL-18的分泌 ，MCC950抑制IL-1β和IL-6分泌；LPS+ATP或LPS+Nigericin同样可以促进BMDM细胞的IL-1β和IL-6的分泌 ，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin对IL-6和IL-1β分泌并无显著促进作用(Fig.2c-2j)。综上所述 ，N蛋白诱导IL-1β的成熟和IL-6的产生 ，并揭示NLRP3是N诱导IL-1β分泌和IL-6产生所必需的 ，因此N蛋白可能在NLRP3炎症小体的激活中发挥重要作用。
接下来研究者对CoV-2
N蛋白在NLRP3炎症小体调控中的作用进行研究。CO-IP结果显示 ，N蛋白仅与NLRP3蛋白相互作用 ，且His-N蛋白可以直接与NLRP3蛋白结合(Fig.3a-3e) ，N蛋白和NLRP3共定位于细胞质中 ，N蛋白与ASC无交互作用(Fig.3f-3i)。所以 ，N蛋白特异性与NLRP3蛋白相互作用 ，调节NLRP3炎症小体分泌。
通过评估N蛋白的截短突变体N1-N8 ，鉴定参与NLRP3相互作用的CoV-2 N蛋白序列。结果表明 ，NLRP3蛋白与N1、N5、N6和N7相互作用 ，并且IL-1β分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20
maturation 亦受N蛋白N1、N5、N6和N7影响(Fig.4a-4e) ，因此 ，N蛋白260aa-340aa截短体参与了与NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎症小体。
接下来研究人员对N蛋白在调节NLRP3炎症小体成分中的作用进行研究。结果显示 ，N蛋白对NLRP3、Caspase-1和ASC的蛋白水平没有影响 ，然而NLRP3存在时N和ASC可以相互免疫沉淀(Fig.5a-5e)。因此 ，该结果提示N蛋白、NLRP3和ASC三个蛋白可能形成一个复杂的N-NLRP3-ASC复合物。N蛋白增强NLRP3与ASC的相互作用在HEK293T和A549细胞并呈剂量依赖(Fig.5f-5g)。同样 ，在PMA-differentiated
THP-1-N细胞中 ，Nigericin促进 N蛋白在NLRP3存在的情况下与内源性ASC相互作用(Fig.5h)。因此 ，CoV-2 N 促进NLRP3与ASC的相互作用。
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对NLRP3在细胞质中进行定位 ，NLRP3呈弥散状分布于细胞质 ，而CoV-2
N蛋白存在时 ，NLRP3呈聚集的斑点状(Fig.6a) ，CoV-2 3a蛋白与NLRP3共定位 ，但未能形成斑点状聚集。CoV-2 N2和N8
截短体 ，同时分布在细胞核和细胞质中且不能与NLRP3和共定位 ，NLRP3在HEK293T细胞的细胞质中未形成斑点状聚集(Fig.6b&6c)。THP-1细胞中NLRP3分布与HEK293T细胞和A549细胞几乎一致 ，且N蛋白存在时 ，内源性NLRP3蛋白在细胞质中聚集形成斑点(Fig.6d&6e)。因此 ，CoV-2
N蛋白可能促进NLRP3炎症小体复合体的形成。
THP-1细胞和BMDM细胞中 ，Nigericin刺激内源性ASC蛋白oligomerization ，并且N蛋白可以促进这一反应(Fig.6f&6g)。此外 ，HEK293T-NLRP3细胞分别转染编码CoV-2-N蛋白及其截短突变体 ，ASC
oligomerization被N1、N5、N6和N7蛋白激活 ，而不受N2、N3、N4、N8蛋白影响(Fig.6h)。所以 ，N蛋白序列260aa-340aa与NLRP3相互作用 ，促进ASC oligomerization。
此外 ，研究人员还探究了N蛋白对NLRP3炎症小体复合物组装的影响。将HEK293T细胞或A549细胞共转染不同质粒 ，GFP同时分布于细胞核和细胞质中 ，NLRP3弥散状分布于细胞质(Fig.7a&7b(a-e));N蛋白和NLRP3表达时 ，NLRP3与N蛋白共定位 ，呈斑点状(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表达时 ，GFP与ASC同时分布于细胞核和细胞质中 ，并形成小的环状结构(Fig.7a&7b(k-o))；N蛋白和ASC表达时 ，N蛋白和ASC无法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；GFP、ASC和NLRP3同时表达时 ，NLRP3和ASC共定位于细胞质并形成环状结构(Fig.7a&7b(u-y))；值得注意的是 ，当N蛋白、ASC和NLRP3同时表达时 ，3种蛋白共定位形成球状结构(Fig.7a&7b(z-d))；当3a、ASC和NLRP3同时存在时 ，3种蛋白共定位未能形成球状结构(Fig.7a&7b(ae-ai))。综上所述 ，CoV-2
N蛋白促进NLRP3炎性小体复合物组装 ，而非CoV-2 3a蛋白。
接下来 ，研究人员对CoV-2
N蛋白在激活NLRP3炎症小体的生物学作用进行评价。通过在C57BL/6小鼠表达N蛋白 ，探究N蛋白在肺损伤中的作用。注射AAVlung-N的小鼠 ，血清中IL-1β和IL-6的水平明显高于对照组 ，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制该反应(Fig.8a&8b) ，但AAVlung表达N蛋白并未影响血清中IL-18的表达(Fig.8c)。AAVlung感染的小鼠肺部免疫荧光结果显示 ，AAVlung-N小鼠肺部IL-1β和IL-6表达明显高于其他分组 ，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可降低IL-1β和IL-6表达(Fig.8d&8e)。HE染色显示 ，携带AAVlung-N的小鼠肺部有明显的的炎症病变及组织损伤 ，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制肺组织的病变(Fig.8f)。这些结果表明NLRP3炎性小体是N蛋白诱导的小鼠肺损伤发生所必需的。
ELISA结果显示 ，AAVlung-N诱导NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表达 ，在NLRP3-/-无明显影响 ，说明NLRP3在N蛋白介导的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b) ，对IL-18激活没有影响（Fig.9c）。并且携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺组织免疫组化结果IL-1β和IL-6的表达明显高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。HE病理染色同样显示携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有明显的炎症病变及组织损伤(Fig.9f)。因此 ，N蛋白通过激活NLRP3炎症小体诱导小鼠全身炎症 ，引发肺损伤。
综上所述 ，研究人员揭示了病理机制 ，其中CoV-2 N蛋白通过促进NLRP3炎症小体的激活从而促进炎症和肺部损伤。
