新生抗原疫苗和溶瘤病毒是能够重塑肿瘤微环境（TME）的新兴免疫疗法
。然而，低突变负荷的肿瘤通常对免疫疗法反应不佳，这是由于其有限的免疫原性所致
。

本文分享一篇发表在Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy（STTT）上的文章，题为“Oncolytic adenovirus delivery of neoantigens sensitizes low-mutation tumors to anti-PD-1 therapy and prevents metastasis（doi：10.1038/s41392-025-02511-5）”

在这篇文献中，复旦大学附属华山医院钦伦秀、苏英晗以及徐州医科大学、海军军医大学国家肝癌科学中心苏长青团队开发了一种名为“NeoViron”的新型溶瘤腺病毒平台，旨在精准地将新生抗原递送至肿瘤细胞，并增强抗PD-1疗法的疗效
。

研究结果表明，NeoViron能够通过扩增新生抗原表达和提升抗原呈递效能，有效增敏低突变肿瘤对免疫疗法的反应，为癌症治疗（尤其是新生抗原稀缺的肿瘤）提供了一种前景广阔的通用型治疗策略
。该研究与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心韩硕教授团队（DOI: 10.1038/s41586-025-09518-6）“背靠背”证实，在肿瘤区扩增或富集肿瘤抗原，放大抗原密度，不仅能够快速清除原发肿瘤，而且还诱导持久免疫记忆，有效防止肿瘤复发转移
。该疗法直接解决了资本敏感的风险点“抗原密度不足”导致癌症疫苗、免疫药物临床失败率过高的痛点
。

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。

·研究背景·

肿瘤新生抗原主要来源于体细胞突变，是能被宿主免疫系统识别为“非己”的肿瘤特异性表位
。这些突变衍生的抗原通过MHC分子呈递，能够在不引发中枢免疫耐受的情况下激活T细胞反应，从而最大限度地减少对健康组织的脱靶效应
。这使得新生抗原疫苗成为个性化癌症免疫治疗的一种有前景的策略
。然而，肿瘤突变负荷（TMB）低的癌症（如胆管癌和胰腺癌）由于新生抗原多样性不足和抗原呈递不佳，导致现有新生抗原疫苗和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1疗法）疗效甚微
。

溶瘤病毒（OVs）能选择性在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，同时OVs作为载体可递送治疗性载荷（如新生抗原）以增强免疫反应
。已有临床批准的溶瘤病毒如Oncorine（oncolytic adenovirus，OAV）和T-VEC（oncolytic HSV）证明了病毒疗法的可行性
。研究表明，OVs通过向肿瘤部位精准递送并扩增特定病毒表位，激活并重定向瘤内与肿瘤无关的旁观者T细胞（TME中存在大量不识别肿瘤抗原，而特异性识别机体既往感染的各类病毒的细胞），使其识别并杀伤表达这些病毒表位的恶性肿瘤细胞
。这为治疗低TMB肿瘤提供了新思路
。

·研究结果·

1、溶瘤病毒介导的新生抗原递送在多种肿瘤模型中引发强大的肿瘤特异性免疫

为确立新生抗原导向的溶瘤病毒疗法的概念验证，作者首先在四种同源的C57BL/6小鼠肿瘤模型（B16F10、MC38、Hep53.4、mICCN-4）中鉴定了其突变谱，整合了全外显子组测序（WES） 与MHC-I免疫肽组的液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS），以检测肿瘤新生抗原
。WES分别在B16F10、MC38、Hep53.4和mICCN-4肿瘤中鉴定出737、179、337和19个非同义单核苷酸变异
。其中，经MS验证的新生抗原包括B16F10中的8个表位、MC38中的6个表位以及Hep53.4中的8个表位（而mICCN-4由于表达量低于检测阈值，未检测到MS可识别的新生抗原）
。值得注意的是，B16F10来源的B8表位与一个先前报道的Ndufs6突变相匹配
。NetMHCpan 4.1预测确认了已鉴定表位的MHC-I结合亲和力
。

接下来作者将每种肿瘤对应的29-mer延伸表位的基因序列串联连接，并将其装载到腺病毒载体的E3区域中，将由此产生的溶瘤腺病毒命名为AdSVP-Nag（图1b）
。实验证明该病毒载体能特异性地在肿瘤细胞中高效复制和递送基因载荷
。在C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型中进行体内功效测试，结果显示，瘤内注射AdSVP-NAg 所实现的肿瘤消退效果，与合成长肽疫苗（SLP）联合空载体瘤内注射的方案相当（图1c）
。值得注意的是，AdSVP-NAgHep在50%的Hep53.4肿瘤中诱导了早期完全缓解，而SLP联合空载体的方案实现了33.33%的早期CR（图1c）
。

ELISpot检测结果显示，AdSVP-NAg与SLP联合空载体治疗均能引发更广泛的新生抗原特异性T细胞反应，针对多个新生抗原的特异性T细胞数量显著增加（图1d）
。通过IHC及免疫荧光染色，检测到溶瘤腺病毒的感染及肿瘤内GZMB+ CD8+细胞毒性T淋巴细胞的浸润增强（图1e）
。综上所述，这些数据证明了溶瘤腺病毒介导的新生抗原递送通过其直接溶瘤作用和适应性免疫激活的双重机制，在多种肿瘤模型中引发了强大的肿瘤特异性免疫反应
。

图1 通过溶瘤腺病毒载体鉴定和递送新生抗原

2、溶瘤病毒递送可克服免疫“冷”型胆管癌中的新生抗原稀缺问题

鉴于通过WES在小鼠ICC细胞系mICCN-4中检测到19个非同义SNVs，且未通过MS鉴定出任何新生抗原表位，作者采用NetMHCpa算法预测了突变衍生的新生抗原表位，并筛选出7个SNVs对应的10个与MHC-I具有结合亲和力的候选表位
。通过ELISpot assay鉴定出，其中有两个表位能在未治疗的荷瘤小鼠中诱导特异性免疫反应（图2a）
。由于OVs能促进肿瘤细胞呈递与肿瘤无关的表位，从而重定向旁观者T细胞靶向肿瘤细胞
。接下来作者利用这10个表位构建了AdSVP-NAgmICC， 并进一步评估其是否能增强新生抗原在ICC细胞中的表达和呈递，以促进免疫系统对肿瘤的识别和破坏
。实验证实，病毒感染96小时后，新生抗原的mRNA表达显著上调（图2b），且其中三个表位（N1、N2、N6）的上调也被LC-MS/MS直接检测到（图2c）
。

更重要的是，AdSVP-NAgmICC在体内对肿瘤生长的抑制作用显著强于SLP联合空载体的方案（图2d）
。这与前述在B16F10、MC38和Hep53.4肿瘤模型中观察到的二者疗效相当的结果（图1c）形成对比，表明递送新生抗原在低突变肿瘤中具有更大优势
。并且实验证明，经过AdSVP-NAgmICC治疗后可以显著增强针对特定新生抗原（N1, N2, N6, N9）的特异性T细胞应答（图2e），在肿瘤细胞内有效复制并表达新生抗原，促进具有细胞毒性的GZMB+ CD8+ T细胞浸润肿瘤（图2f,g）
。这些数据表明，OAV介导的新生抗原扩增能够促进免疫系统更有效地识别和清除表达新生抗原的肿瘤细胞，从而克服诸如ICC等低突变负荷肿瘤的免疫逃逸机制
。

图2 AdSVP-NAgmICC在罕见突变ICC中的疗效

3、在OAV中共表达Flt3L可进一步增强DC介导的抗肿瘤免疫及其抗肿瘤效果

为了放大抗原呈递，作者构建了AdSVP-Flt3L，用以分泌DC生长因子Flt3L
。为了探究分泌的Flt3L对DC细胞的影响，作者将小鼠骨髓来源的DC细胞与AdSVP-Flt3L感染细胞的条件培养基共培养，发现该条件培养基能显著促进DC细胞的体外增殖，且呈浓度依赖性，尤其有利于其向Ⅰ型经典树突状细胞（cDC1）分化
。此外，在mICCN-4和Hep53.4的皮下移植瘤小鼠模型中，瘤内注射AdSVP-Flt3L能显著抑制体内肿瘤生长，并提高血液和肿瘤组织中的Flt3L水平（图3a, b）
。流式细胞术和免疫荧光分析表明，瘤内DC/cDC1群体显著增加（图3c, d）
。

基于AdSVP-NAgmICC和AdSVP-Flt3L取得的良好结果，作者开发了一种新型OAV——NeoViron，其设计为通过F2A肽共表达Flt3L和新生抗原（图3e）
。尾静脉注射NeoViron未引起明显不良反应，也未感染肝、肺、肾等主要器官
。与单独使用AdSVP-NAgmICC或AdSVP-Flt3L相比，瘤内注射NeoViron能诱导更强的肿瘤抑制效果（图3f），并显著增强瘤内CD8+ T细胞的浸润，特别是PD-1+ GZMB+ CD8+ T细胞的比例及显著增加DC/cDC1细胞群（图3g,h）
。此外，体内CD8+细胞耗竭消除了NeoViron介导的肿瘤控制作用
。这些结果表明，NeoViron通过协同促进cDC1募集和增强CD8+ T细胞毒性，实现了优于单一疗法的肿瘤控制效果
。

图3 NeoViron的构建及体内验证

4、协同性免疫检查阻断释放耗竭T细胞潜力以增强NeoViron疗效

由于NeoViron在增强DC/cDC1和PD-1+ GZMB+ CD8+ T细胞招募的同时，也引起了一定程度的PD-1+ GZMB- CD8+ T细胞增加，后者是潜在的T细胞耗竭指标（图3g）
。因此，作者猜想将NeoViron与抗PD-1联合使用可能进一步提升疗效
。正如预期的那样，与单独使用NeoViron相比，NeoViron联合抗PD-1在mICCN-4皮下移植瘤模型中对肿瘤生长的抑制更为显著
。为了更好地了解其对肿瘤免疫微环境的潜在影响，作者在原位移植小鼠模型中通过超声引导下瘤内注射NeoViron，该联合疗法缩小了原位ICC肿瘤的体积，延长了小鼠的生存期，且未引起任何体重下降或明显不良反应（图4b-e）
。

此外，与NeoViron单药治疗相比，联合治疗显著促进 GZMB+ PD-1+ 细胞毒性CD8+ T细胞的浸润（图4f），并且联合疗法也增加了DCs和cDC1s的浸润
。mIHC揭示了肿瘤区域内cDC1与CD8+ T细胞协调的相互作用（图4g）
。这些结果表明，抗PD-1疗法能够进一步增强由NeoViron诱导的新生抗原特异性T细胞的细胞毒性，该联合方案在诸如低突变的ICC等实体瘤中展现出协同效应
。

图4 NeoViron与抗PD-1具有协同作用

5、联合疗法促进CD69+ CD8+ Trm和TCF1+ CD8+ Tstem细胞的克隆扩增

为深入揭示其潜在机制，作者对经NeoViron处理的肿瘤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）
。scRNA-seq结果共鉴定出10个细胞群体，其中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和树突状细胞在联合治疗组中数量增加（图5a）
。流式结果显示：联合治疗后，IFN-γ+ CD4+ T细胞和cDC1均有所增加
。CD8+ T细胞被聚类为七个亚群，包括：

①CD8_T1_Gzmb

以高表达Gzmb、Prf1 和Ifng 等细胞毒性分子及组织驻留标记Cd69 为特征，与组织驻留记忆T细胞（Trm）一致
；

②CD8_T2_Tcf7

以表达干性相关转录因子Tcf7 为特征，代表干细胞样T细胞（Tstem）
；

③CD8_T3_Cxcr4

共表达Cd69 和Tcf7，可能代表T1和T2之间的中间状态
；

④CD8_T4_Ifit3

高表达干扰素应答相关基因
；

⑤CD8_T5_Maml2

不表达任何效应分子，可能代表静息态T细胞
；

⑥CD8_T6_Klrg1

具有高水平的细胞毒性分子但Cd69 阴性，占比较少
；

⑦CD8_T7_Mki67

代表增殖性T细胞，以高表达Mki67 为特征（图5b, c）
。

联合治疗后，瘤内CD8_T1_Gzmb、CD8_T2_Tcf7和CD8_T3_Cxcr4的浸润显著增强（图5d）
。Monocle3拟时序分析揭示了从CD8_T2_Tcf7到其他CD8+ T细胞亚群的分化轨迹，这与其干样特征相符（图5e）
。作者重点关注从CD8_T2_Tcf7经CD8_T3_Cxcr4到CD8_T1_Gzmb的轨迹，沿此轨迹，Cd69、Gzmb 和Prf1 的表达在此转化过程中增强，而Tcf7 表达下降（补充图7d）
。CD8_T1_Gzmb在所有亚群中呈现最高的细胞毒性分子Gzmb 和Prf1 表达，其在NeoViron治疗后显著增加，并且其细胞毒性可被抗PD-1进一步增强（图5f）
。细胞间通讯分析揭示了cDC1与CD8_T1_Gzmb之间存在更强的相互作用，该作用主要由MHC-I信号通路介导（图5g）
。此外，通过免疫荧光进一步验证了NeoViron与抗PD-1联合治疗后，瘤内CD69+ CD8+ Trm细胞和TCF1+ CD8+ Tstem细胞的浸润增加（图5i）
。总之，对NeoViron处理肿瘤的scRNA-seq分析揭示了干细胞样TCF1+CD8+T细胞的克隆性扩增及其向Trm (CD8_T1_Gzmb) 亚群的分化
。

作者进一步收集了HCC和CCA患者的术后样本，以探究这两个细胞群体与临床预后之间的关联
。作者对肿瘤中浸润的CD8+ T细胞、Trm和Tstem细胞进行了定量分析，并以中位数为临界值将患者分组，比较两组间的总生存期（OS） 和无复发生存期（RFS）
。结果表明，肿瘤中CD8+ T细胞浸润高与低的患者之间预后无显著差异
。然而，与Trm低浸润患者相比，Trm高浸润患者的OS和RFS均显著延长
。此外，与Tstem低浸润患者相比，Tstem高浸润患者的OS和RFS也呈现出延长的趋势（图5j, k）
。另外，作者利用TCGA数据库中CCA和HCC患者的转录组数据，根据每种T细胞亚型的特征基因对患者进行高低分组，并进行了生存分析
。具有高Trm浸润特征的HCC患者较低Trm组具有更长的OS和RFS
。然而，由于样本量有限，在CCA患者中未观察到两组间的显著差异（补充图8c, d）
。

综上所述，这些结果证明，NeoViron促进了TCF1+ CD8+ Tstem细胞和CD69+ CD8+ Trm细胞的扩增
。TCF1+ CD8+ Tstem细胞具有分化为各种CD8+ T细胞亚型的能力，尤其是CD69+ CD8+ Trm细胞，后者在所有亚型中表现出最强的细胞毒性活性
。临床样本的结果也提示了NeoViron可能具有潜在的长期
；ばв，预示了其转化潜力
。

图5 联合治疗可促进CD69+ CD8+ Trm和TCF1+ CD8+Tstem细胞的扩增

6、NeoViron诱导的CD69+ CD8+ Trm细胞可抵抗肿瘤转移

为进一步评估NeoViron诱导的适应性免疫应答的
；ば孕в，作者建立了一个预防肿瘤转移小鼠模型，处死mICCN-4小鼠并收集肝脏或肺脏以评估转移情况（图6a）
。HE染色结果显示，NeoViron显著减小了肝转移瘤的尺寸并减少了肺转移灶的数量（图6b, c）
。除ICC外，AdSVP-NAgHep联合AdSVP-Flt3L 的方案也显示出对HCC转移的预防作用（图6d-f）
。免疫荧光染色显示，在mICCN-4和Hep53.4模型中，经NeoViron或AdSVP-NAgHep联合AdSVP-Flt3L治疗的小鼠，其肝和肺转移灶内均检测到成簇分布的CD69+ CD8+ Trm细胞（图6g, h）
。这些结果表明，NeoViron诱导的CD8+ Trm细胞与转移预防呈正相关
。

图6 NeoViron诱导的CD8+ Trm细胞阻止肿瘤转移

·全文总结·

本研究成功开发并验证了一种名为“NeoViron”的新型溶瘤腺病毒平台，通过将新生抗原基因与Flt3L基因同时整合到经过改造、具有肿瘤靶向性的溶瘤腺病毒中，创造了多功能一体化的NeoViron平台
。它形成一个强大的协同闭环：通过溶瘤病毒递送并放大新生抗原信号，同时利用Flt3L招募和激活最有效的抗原呈递细胞（cDC1） 来呈递这些信号，最终在肿瘤内建立并维持两类关键的CD8+ T细胞（Trm和Tstem），从而实现对低突变肿瘤的有效杀伤、长期免疫监控和转移预防
。该方案与抗PD-1疗法协同增效，能有效逆转T细胞耗竭，实现强大的原发性肿瘤清除与转移预防，展现出极高的临床转化潜力
。这为治疗目前对免疫疗法反应不佳的低TMB肿瘤（如肝内胆管癌、胰腺癌等）提供了一种极具转化前景的新策略，并展示了溶瘤病毒作为多功能免疫治疗平台的巨大潜力
。

图7 NeoViron抗肿瘤机制示意图

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