腺相关病毒（AAV）是基因治疗领域的理想载体
，它具有非致病性、可感染分裂与非分裂细胞、能介导基因长期稳定表达且插入突变风险低等优势
，已在视网膜病变、血友病等多种遗传病的临床治疗中获批应用。但AAV存在一个关键技术瓶颈——包装容量通常小于5kb
，这使得超过该长度的大基因无法被有效递送。为解决这一问题
，科研人员开发出DNA反式剪接、RNA 反式剪接、蛋白反式剪接等策略
，但这些方法普遍存在基因重构效率低、易产生截短蛋白副产物、依赖特定切割位点等缺陷
，难以满足临床治疗的需求。

2026年1月27日
，中国科学院深圳先进技术研究院路中华研究员、刘太安副研究员团队与北京大学第一医院姜玉武教授团队联合在Cell发表题为“AAVLINK: A potent DNA-recombination method for large cargo delivery in gene therapy”的研究论文。研究团队开发出基于Cre/loxP介导的分子间DNA重组技术的AAVLINK系统
，旨在实现大基因的高效、精准递送。

·研究结果·

一、AAVLINK系统的设计与优化

AAVLINK采用双载体设计突破容量限制
，核心依赖Cre/loxP位点特异性重组机制。其中一个载体携带目的基因（GOI）的5'端序列和剪接供体（SD）
，另一个载体携带Cre重组酶序列、lox位点、目的基因3'端序列及poly(A) 信号。

该系统的重组过程分为三步：第一步是Cre重组酶表达；第二步是Cre介导两个载体的lox位点重组
，将目的基因的5'端与3'端连接
，同时使Cre编码序列与表达元件分离
，实现其表达自抑制；第三步是重组后的基因经RNA剪接
，最终表达出全长目的蛋白。

为降低重组的可逆性
，研究团队采用了不对称突变的lox位点（loxJT15和loxJTZ17）
，重组后产生的双突变lox位点无法被Cre识别
，使重组过程不可逆。实验验证显示
，该系统在HEK293T细胞、小鼠皮层及食蟹猴脑组织中均能高效重构增强型黄色荧光蛋白（EYFP）
，且几乎不产生截短蛋白
，Cre重组酶的表达也会在重组完成后快速降至基线水平。

图1. AAVLINK的设计与优化

二、三载体系统拓展超大基因递送能力

为进一步承载更大的基因片段
，研究团队开发了三载体AAVLINK系统。该系统引入两组互不干扰的lox位点
，第一组负责连接目的基因的5‘端与中间片段
，第二组利用带有spacer突变的lox2272位点连接中间片段与3'端
，避免不同lox位点之间的交叉反应。

实验中
，研究人员将红色荧光蛋白（TagRFP）基因拆分为三段并分别装入三个载体
，在HEK293T细胞、小鼠及食蟹猴脑组织中均实现了高效的全长蛋白表达
，且无截短副产物。经测算
，三载体AAVLINK系统的有效递送容量可达11kb
，足以覆盖绝大多数人类遗传病相关的大基因。

图2. AAVLINK三载体系统递送基因

三、相比传统方法
，AAVLINK具有显著效率优势

研究团队将AAVLINK与主流的内含肽（Intein）介导蛋白重组、StitchR mRNA反式连接技术进行了全面对比。在荧光素酶报告基因实验中
，双载体AAVLINK的重构效率最高是内含肽方法的23.3±1.3倍
，三载体系统的效率更是达到后者的245.5±156.7倍。

在体内实验中
，通过小鼠眼眶后注射递送荧光素酶基因
，AAVLINK的发光强度是内含肽方法的4.5±1.4倍。针对Shank3（5.4kb）、CEP290（7.4kb）等大基因的重构实验显示
，AAVLINK的蛋白表达量远超内含肽方法
，且全长蛋白占比高达83.4%±2.4%
，而内含肽方法的全长蛋白占比仅为0.2%。与StitchR技术相比
，AAVLINK在细胞和小鼠脑组织中的基因重构效率也具有明显优势。

图3. AAVLINK与内含肽方法的比较

四、AAVLINK在疾病模型中验证治疗潜力

研究团队在两种遗传病小鼠模型中验证AAVLIN的治疗效果。在Shank3基因敲入突变的Phelan-McDermid综合征模型中
，向小鼠纹状体注射携带Shank3基因的AAVLINK载体后
，脑组织中检测到大量全长Shank3蛋白表达
，小鼠的刻板行为和运动能力缺陷得到显著改善。

在SCN1A基因缺失的Dravet综合征（一种难治性癫痫）模型中
，新生小鼠经眶后静脉注射 AAVLINK-SCN1A载体后
，脑内成功表达Nav1.1蛋白
，小鼠的高热诱导癫痫发生率显著降低
，存活时间大幅延长。电生理实验证实
，治疗后的小鼠海马锥体神经元兴奋性恢复正常
，快放电中间神经元的功能也得到修复
，癫痫相关的皮层脑电异；疃飨约跎。

图4. AAVLINK介导的基因替换疗法在PMS和Dravet综合征小鼠模型中的应用

五、高效递送CRISPR工具
，拓展基因编辑应用场景

AAVLINK还可用于递送体积庞大的CRISPR基因编辑工具。研究人员将SpCas9、腺苷碱基编辑器ABE8e、胞嘧啶碱基编辑器YE1-BE4max、转录激活因子dSpCas9-VPH等工具拆分为两段
，通过双载体AAVLINK递送
，在细胞中实现了高效的蛋白重构与功能验证。

在体内实验中
，AAVLINK递送的SpCas9可在小鼠肝脏中实现Rosa26位点的精准切割；递送的ABE8e可编辑Pcsk9基因
，有效降低小鼠体内的Pcsk9蛋白水平；递送的dSpCas9-VPH则能在小鼠海马中特异性激活SCN1A基因的表达
，为基因编辑疗法的体内应用提供了新方案。

图5. 通过AAVLINK递送CRISPR工具

六、AAVLINK2.0升级
，提升生物安全性

为解决Cre重组酶长期表达可能带来的生物安全隐患
，研究团队开发了升级版的 AAVLINK2.0系统。该系统通过两步优化降低Cre的残留表达：一是选用弱启动子SCP1驱动Cre表达
，减少其初始表达量；二是在Cre蛋白C端融合降解标签UDeg3a
，加速Cre的蛋白降解。

实验结果显示
，AAVLINK2.0在维持高效基因重构能力的同时
，Cre蛋白的表达水平降至Western blot检测下限
，在小鼠和食蟹猴脑组织中均未检测到Cre的残留信号
，极大提升了该系统的临床转化潜力。

图6. AAVLINK2.0系统中Cre表达最小化

七、构建198个大基因资源库
，开放共享科研工具

研究团队基于AAVLINK系统构建了一个大基因递送资源库
，涵盖193个与遗传病相关的大基因（包括166个自闭症风险基因和27个其他遗传病基因）和5个CRISPR工具。所有基因均在细胞水平验证了DNA重组和蛋白表达的有效性
，相关载体信息已上传至Addgene等质
？
，并搭建了专用网站（http://AAVLINK.com/）供科研人员查询和获取。

图7. 用于遗传疾病相关大基因递送的AAVLINK资源库

·总结·

AAVLINK系统的研发与应用
，为基因治疗领域长期存在的大基因递送难题提供了突破性解决方案。通过Cre/loxP介导的精准重组机制
，结合双载体与三载体的灵活设计
，该系统不仅突破了传统AAV载体的容量限制
，更在效率、特异性和生物安全性上实现了多重优化
，其2.0版本对Cre表达的精准调控进一步降低了临床应用风险。从疾病模型的成功救治到CRISPR工具的高效递送
，再到198个大基因资源库的构建
，AAVLINK展现出横跨基础研究与临床转化的广泛价值
，为自闭症、难治性癫痫等因大基因缺陷导致的遗传病提供了全新治疗路径。

图8. AAVLINK系统模式图

原文链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)01488-6

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